外泌体的透射电镜制样技术简介

摘要：外泌体的透射电镜制样技术简介

外泌体的透射电镜制样技术简介

外泌体（exosom）是细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）中的重要组成部分，由于他们含有丰富的生物标志物，在细胞的社交网络里充当重要角色，作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到关注。根据国际细胞外囊泡协会2014年发表的一个指导手册（MISEV），用透射电镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征是鉴定EV的基本方法之一。外泌体的30~150nm杯状膜性微囊结构，可采用透射电镜负染色技术观察记录。

（1）  试验样品的准备

实验样品为脐静脉内皮细胞源的外泌体小泡。提取方法如下。

①梯度离心    细胞培养基先后300g（10min）、2000g（10min）、18000g（30min），4℃低温离心，离心后收取上清液，0.22μm滤器过滤，以去除培养基中的死细胞、细胞碎片、微泡及凋亡小体。

②超滤    将上述培养基用于1×10⁵超滤管浓缩为2mL左右。

③蔗糖重水垫    将0.6mL的300g/L蔗糖重水溶液（密度1.210g/cm³）加到超离管中，将含有外泌体的液体小心加到蔗糖重水垫的上方，以PBS缓冲液补足体积。使用超速离心机以110000g速度4℃低温离心70min。

④吸弃上层PBS，收集含有外泌体的蔗糖重水层，以10mL左右冷PBS稀释后加到1×10⁵超滤管中浓缩为0.2mL左右。将上述0.2mL超滤液加到超离管中，以PBS补足体积，超速离心机110000g低温离心70min，管底可见黄白色沉淀物。

⑤弃上清，将沉淀物以4mL冷PBS重悬，110000g低温离心70min，弃上清，所得沉淀物即为纯化后的外泌体。采用BCA试剂盒定量。-80℃冰箱保存。注意所有离心都必须在4℃低温进行。

（2）  实验试剂与材料准备

①新鲜配制的PBS缓冲液（pH 7.4）。

②2.5%戊二醛固定液（pH7.0~7.4）。

③40g/L乙酸双氧铀染液（pH7.0~7.4）。

④新鲜配制的10g/L甲基纤维素溶液（25cps）。

⑤带有覆碳Formvar支持膜的洁净载网。

（3）  外泌体负染色实验步骤

①备好的封口膜洁净面朝上放，将新鲜外泌体外泌体溶液滴在上面。

②将载网的膜面放在外泌体液滴上，悬浮10min，用滤纸缓慢吸干。

③转移载网到2.5%戊二醛液滴上，悬浮5min，用滤纸吸干。

④将载网转移到去离子水液滴上，每次2min，10次，每次均用滤纸吸干。

⑤转移载网到40g/L乙酸双氧铀液滴上，10min，用滤纸吸干。

⑥转移载网到10g/L甲基纤维素液滴上，5min，用滤纸吸干。

⑦自然晾干（≥30min）后透射电镜观察记录。

（4）  外泌体负染色实验注意事项

外泌体负染色看起来很简单，但要获得清晰的膜结构尚需斟酌具体操作细节。上述实验方法基本参考了Thery（2006）的方法，容易获得较高成功率。

实验注意事项：①所有操作均在低温下进行，封口膜铺在培养皿上，培养皿放在冰块上，保持低温环境；②在所有操作步骤中，让液体仅吸附于载网的有膜面，使无膜面保持载网干燥；每一次换液，均更换洁净封口膜；③控制甲基纤维素薄膜的厚度对获得最佳对比度和精细结构至关重要，甲基纤维素使用前充分溶解，4℃保存；④在配制和使用乙酸双氧铀操作中，注意防护和避光。

文章摘自《生命科学中的电子显微镜技术》

主编：丁明孝、梁凤霞、洪健、李伯勤、王素霞、朱平。